水蛭始载于《神农本草经》[1]，是我国传统的活血化瘀药。2015年版《中华人民共和国药典》规定水蛭药材为水蛭科动物蚂蟥(宽体金线蛭)Whitmania pigra Whitman、水蛭(日本医蛭)Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥(尖细金线蛭)Whitmania acranulata Whitman的干燥全体，具有破血通经，逐瘀消癥的功能，主治血瘀经闭，癥瘕痞块、中风偏瘫、跌打损伤[2]。水蛭中含有多种抗凝剂，已发现的可直接作用于凝血系统的成分有水蛭素、吻蛭素、类肝素、组胺等[3]。现代药理研究表明水蛭在防治动脉粥样硬化、抗凝血、抑制血栓、抗肿瘤等方面具有良好的疗效[4-8]。近年来，我国以水蛭为原料药材的中成药有90余种[9-10]，其中通心络胶囊、脑血康滴丸、脑心通胶囊等中成药被纳入2019年的《国家基本医疗保险、工伤保险和生育保险药品目录》[11]。近年来，水蛭市场需求锐增、生态环境不断恶化、群众滥捕滥捉使得水蛭野生资源大幅减少，水蛭价格显著上涨[12-13]，不法商贩常使用混伪品、肚内填充异物、加明矾腌渍、加盐增重等掺假手段来谋利[14]，亟需建立准确有效的水蛭药材真伪鉴别方法，为水蛭药材的临床用药安全与疗效提供有力保障。

传统鉴定方法因受到遗传可变性[15]、表形可塑性[16]、化学成分复杂性[17]的影响，常常具有一定的局限性。20世纪70年代末期以来，随着分子生物学和信息学的快速发展，产生了更加直接、准确的分子鉴定方法。1980年，Botsein等[18]提出限制性内切酶片段长度多态性技术(RFLP)，其基本原理是基因组经限制性内切酶消化后，通过Southern印迹和特定序列探针杂交后显示出遗传位点的等位变异，结果稳定可靠，但操作复杂、耗时较长，实践中常使用与聚合酶链式反应技术(PCR)结合的PCR-RFLP技术进行鉴定。期间，蛋白质电泳分离技术[19]被广泛应用于分子诊断。1990年，Williams等[20]提出以PCR为基础的随机扩增多态性DNA标记(RAPD)技术，但扩增结果的稳定性较差。简单重复序列标记(SSR)通过设计的引物进行扩增，快速稳定，且多态性较高，呈共显性遗传，被广泛用于种质鉴定[21]。1993年，Zabeau Mare和Vos Pieter[22]发明了扩增片段长度多态性技术(AFLP)，其基本原理是对基因组酶切片段进行选择性扩增。1991年，香港中文大学邵鹏柱团队[23]运用了RAPD和随机引物PCR技术(AP-PCR)在人参与西洋参中进行DNA指纹鉴别，发表了第一篇中药分子鉴定英文论文。1994年，Zietkiewicz等[24]提出了简单序列重复区间扩增多态性技术(ISSR)。目前，2010年版《中华人民共和国药典》[25]收载了蕲蛇、乌梢蛇的PCR鉴定方法，2015年版《中华人民共和国药典》增补本已公示金钱白花蛇的快速PCR鉴定方法[2]。此外，川贝母的PCR-RFLP鉴定方法也被纳入了2015年版《中华人民共和国药典》[2]。

根据我国《汽车金融公司管理办法》，汽车金融公司的资金只能来源于股东资金、银行借款、同行拆借和少量债券融资。资金来源渠道的单一，使得互联网汽车金融行业的业务难以拓展和扩大，限制了其业务发展规模，不利于互联网汽车行业的发展壮大。

纵向看，北京版、冀教版、苏教版、青岛版的性质1与冀教版、青岛版的性质2，在第二和三学段教材中的发现过程，不仅活动内容不同，而且知识或思维要求也不同；它们仅在第三学段教材中具有证明和应用内容．可见，多数版本性质1和性质2发现、证明和应用的教材编写随着学段升高，思维要求在递升，深度在加深．当然，在第三学段的各版教材中，平行四边形的其它一些性质和判定的内容深度与相应教材的性质1、2基本一致．

2003年，Hebert等[26]首次提出DNA条形码技术，这是利用基因组中一段公认的、相对较短的DNA序列来鉴定物种的一种分子生物学技术，不受经验限制与环境影响，已成功应用于僵蚕[27]、水牛角[28]、金钱白花蛇[29]、哈蟆油[30]等动物药材鉴定研究。2014年，石林春等[31]构建了包含800余种动物药材及其混伪品和密切相关物种的“中国动物药材DNA条形码数据库”。许多优秀的中药分子鉴定专著也先后出版，如《中药DNA条形码分子鉴定》[32]《中国药典中药材DNA条形码标准序列》[33]等。2010年版《中华人民共和国药典》增补本正式收载中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则[25]，标志着中药分子鉴定成为继四大经典方法之后的新鉴定方法。随着高通量测序技术的飞速发展，更多的基因信息可被获得，基因信息的开发、利用以及基因信息库的构建使得分子鉴定技术全面推广。2018年，陈士林等出版了“十三五”规划教材《本草基因组学》专著[34]，引领现代组学技术在中医药研究中的应用，也为中药分子鉴定提供更多的资源。

DNA分子鉴定技术[35]是从核酸层面对中药材进行快速、准确的鉴定，包括基于PCR的分子鉴定技术以及DNA条形码技术，其中DNA条形码鉴定技术应用最为广泛。

1 DNA分子鉴定

水蛭的分子鉴定方法随着中药分子鉴定技术的进步而不断发展，见图1。本文将从DNA分子鉴定和蛋白质标记技术两大类简述近年来水蛭分子鉴定方法的研究进展，分析总结不同分子鉴定技术在水蛭药材真伪鉴定中的应用特点，旨在为今后水蛭分子鉴定方法的深入研究提供参考和借鉴。

1.1 基于PCR的分子鉴定技术 直接PCR技术[36]以微量组织样品的裂解物为DNA模板，借助灵敏、抗干扰能力强的Taq DNA聚合酶进PCR扩增。SNP分子标记能够为品种鉴定提供准确、快速的检测渠道[37]。在水蛭鉴定中，常用的PCR分子鉴定技术有简单序列重复区间扩增多态(ISSR)、相关序列扩增多态性(SRAP)、随机扩增多态性DNA标记(RAPD)、简单重复序列标记(SSR)。Liu等[38]采集了全国蚂蟥分布区的八个省份的样本，用ISSR和SRAP对遗传多样性在物种水平上进行研究，SRAP与ISSR结果较为一致，聚类分析表明蚂蟥种群间有较高水平的遗传分化。与SRAP相比，ISSR的显性表现及通用性会更好，稳定性高，且无需预先克隆和测序，但ISSR准确性稍弱。刘飞等[39]采集了225个蚂蟥样本，利用RAPD进行遗传多样性分析，聚类分析结果表明在物种水平上群体间分化较大，种群内存在一定程度变异，与Liu等结果较为一致。刘飞等[39]还对蚂蟥进行了SSR开发，利用和生物素特异性结合、限制性内切酶消化的2种策略建立SSR文库，结果2种方法都可高效开发出SSR序列。

2.3 蛋白飞行时间质谱技术 蛋白飞行时间质谱鉴定技术[52]采用了飞行时间质谱与荧光标记技术对中药中所含肽和蛋白质种类组成进行分析来鉴定中药的方法，可建立出动物类中药蛋白或肽成分的质量指纹图谱，在羚羊角[55]、阿胶[56]、地龙[57]等药中已成功应用。Baskova[58]利用表面增强激光解析电离飞行时间质谱对水蛭唾液腺分泌物蛋白做分析，从而辨析出几种水蛭蛋白的组成异同，实现在蛋白质水平上的高效、高通量分离鉴定。此方面的实验[59-61]应用在水蛭中大多是采用电感耦合等离子质谱(ICP-MS)或质谱技术对水蛭药材重金属元素进行检测研究，在使用蛋白飞行时间质谱鉴定技术对水蛭进行鉴定还需进一步探索研究。

2.1 蛋白质电泳鉴定技术 蛋白质电泳鉴定技术[52]是依据中药中所含蛋白质分子的大小、形状或所带电荷差异，采用电泳分离来鉴定中药的方法，常用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和毛细管电泳(CE)。丁月珠[53]对蚂蟥清水吊干品、菲牛蛭干品、菲牛蛭鲜品采用十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法检测3种水蛭样品对纤维蛋白原的作用，结果发现蚂蟥清水吊干品对纤维蛋白原有水解作用，尤其是对α、β链的作用较强，而菲牛蛭干品与菲牛蛭鲜品对纤维蛋白原均无此作用。因此，SDS-PAGE法可将蚂蟥与菲牛蛭成功鉴别。

2 蛋白质标记技术

2.2 同工酶鉴定技术 同工酶鉴定技术[52]是依据待鉴定中药中同工酶的分子结构、活性以及免疫原性等的特异性，使用酶活性分析、电泳检测等技术来鉴定中药品种的方法。罗媛媛等[54]对日本医蛭和天目山蛭的4种同工酶(ES、MDH、POX、LDH)采用垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较研究，结果显示4种同工酶在日本医蛭和天目山蛭中的表达程度和LDH同工酶谱对比具有相似性，说明日本医蛭和天目山蛭在遗传上具有一定相似性，可能存在一定亲缘关系。这与分类学结果相吻合，其同属于无吻蛭目医蛭形亚目。

此次观摩会召开得非常成功，正如青岛市和平度市两级土肥站负责人在会上讲话时所说，有了全国农技推广中心和澳特尔化工技术推广部的合力支持，先进的农业科学技术必将落实到农村的田间地头，定会为广大种植户带来良好收益，为大泽山的葡萄增产增收再创新高。

Elizabeth等[42-43]针对蛭纲53个物种进行了COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA序列分析，得到系统进化分类结果与传统的分类学结果不完全一致，认为有3个物种应归为医蛭科，欧洲山蛭的3个新物种实际可能是南美洲山蛭的入侵物种。刘飞等[44]对宽体金线蛭及水蛭的DNA序列进行ITS测序分析，结果也发现系统分类结果与分类学结果不完全一致，与Elizabeth等的结果相似，究其原因可能是ITS序列在进化时发生了碱基间的转换、颠换和缺失等少量位点变异。同年，Lai Y T.等[45]对台湾的几个黄蛭科新种利用COI、12S rRNA、16S rRNA的部分片段对进行分析，结果可成功实现种类鉴定。此后，刘晓帆[46-47]采集的12个水蛭样品(蚂蟥、水蛭、柳叶蚂蟥与其混伪品菲牛蛭、天目山蛭等)在条形码长度及GC含量上均有差异，在N-J遗传树中水蛭正品来源与各种混伪品不聚集在一起，可将水蛭药材与混伪品区分，菲牛蛭与水蛭十分相近，但还是各自分成独立的一支。说明各物种相互之间可明显区分，因此得出基于COI序列的DNA条形码技术适用于药材水蛭的鉴定。徐云玲等[48-50]增加了与刘晓帆等不同物种的水蛭(光润金线蛭、八目石蛭)，对COI、12S和16S基因进行测序来构建分子系统树，发现每种水蛭均形成独立分支，成功将这6种水蛭进行鉴定分类，也得出了与此前研究相同的结果。肖凌[51]对宽体金线蛭、日本医蛭、尖细金线蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭、光润金线蛭、日本山蛭及八目石蛭共8个物种进行鉴定，比之前的研究又增加了新物种与新基因片段序列(ITS2、COI、12S rRNA、16S rRNA等)，考察序列种间、种内变异的Barcoding Gap，最后也得出相同结论，还提出了可将12S rRNA作为医用蛭类较为合适的DNA条形码序列。综上所述，应用COI及12S rRNA联合序列在种内保守、种间差异较大的片段设计特异引物可准确鉴别水蛭药材与混伪品。

蛋白质标记技术[52]是从蛋白质层面对中药材进行快速、准确的鉴定，包括抗血清鉴定技术、蛋白质电泳鉴定技术、同工酶鉴定技术以及蛋白飞行时间质谱鉴定技术，但将抗血清鉴定技术运用于水蛭鉴定还需进行进一步研究探索。

1.2 DNA条形码鉴定技术 DNA条形码鉴定技术是通过利用标准DNA片段对物种进行鉴定的方法。中药材DNA条形码分子鉴定法指导原则提出动物类药材采用细胞色素c氧化酶亚基I(COI)序列为主，转录间隔区间2(ITS2)为辅的中药材鉴定体系[2]。据文献报道[40-41]，在应用DNA分子标记技术对水蛭鉴定时，常用COI、18S rDNA、28S rDNA、12S rRNA等分类序列，其中COI是进化较快的序列。

六是创新乡村治理体系，走乡村善治之路。不仅要处理好解决农村社会矛盾、规范干群关系等老问题，还要根据城镇化发展、人员流动、社会资本下乡等带来乡村经济社会结构的新变化，不断提升治理体系和治理能力现代化。这就要求探索乡村共建共治共享的善治新模式，抓住加强农村基层党组织建设这个关键的“牛鼻子”，发挥基层党组织领导核心作用，健全村民自治、法治和德治有机结合的乡村治理体系，确保乡村社会和谐有序。

3 讨论

3.1 水蛭市场现状 2015年版《中华人民共和国药典》规定的中药材水蛭的基原物种为水蛭科动物蚂蟥、水蛭或柳叶蚂蟥，然而市场常见品种主要为宽体金线蛭，日本医蛭数量极少，甚出现大量非药典规定的水蛭品种制作的水蛭药材，如牛蛭属的菲牛蛭、湖北牛蛭等[62]。中药材水蛭市场比较混乱，其原因是多方面的：一是各地用药习惯的差异。由于南北差异较大，各地用药习惯有着显著区别。菲牛蛭是西南水蛭的代表品种，被收录进2005年版《广西中药材标准》[63]与2005年版《云南省中药材标准》[64]，它符合部分地方用药标准，但却不满足2015年版《中华人民共和国药典》的规定。二是同科属的水蛭品种性状上的相似性常造成误用现象。常规性状鉴定只能区分到科级别，若需定种，则须观察环节数、生殖孔等细微特征，然而在加工成药材的过程中，这些细微的特征常遭到破坏，大大增加了性状鉴定的难度。并且水蛭的性状会受到外界环境变化的影响，不同地区的水蛭在大小，性状上也存在着细微差别，这些都对水蛭药材的常规鉴定提出了挑战。水蛭药材及其各种混伪品的粉末在显微镜观察下差异较小[42]，无法通过显微鉴定辨别真伪。而在药材薄层鉴定中，可能是由成分含量的差异不明显，正品和伪品与标准药材在相同位置形成相同颜色的点[30]，无鉴别意义。三是水蛭药材品种的历史遗留问题。关于水蛭的药用品种始终存在争议。通过本草考证，我们可以发现各古籍文献中对于水蛭的药用品种描述均不够详细，只是简单地强调了一下水蛭的药用品种不包括石蛭、泥蛭、山蛭及其诸小者，并且药用水蛭以“小者为佳”，并不涉及水蛭药用品种的具体形态特征的描述，如《蜀本草》[65]记载：“勿误采石蛭、泥蛭用。石、泥二蛭，头尖，腰粗，色赤，不入药，误食之，则令人眼中如生烟，渐至枯损”。关于水蛭的药用品种始终存在争议，一些文章也对水蛭在药典中规定的品种提出了增补修改建议[66]。四是供需缺口的扩大致使不法商贩掺假混用。由于近年来水蛭市场需求不断扩大，然而现有药用品种的水蛭野生资源大幅减产，且相关人工养殖技术仍不够成熟，无法供应水蛭药材需求，造成药材价格连年上涨，不法商贩因此打着进口水蛭药材品种[67]的幌子贩卖非药用品种的水蛭药材。其中，由于海南菲牛蛭资源较多，且菲牛蛭干品具有明显的抗凝抗血栓活性[68]，常被掺入混用。

3.2 分子鉴定技术在水蛭鉴定中的特点 基于PCR的分子鉴定技术具有多样性[69]，最大的特点是以微量样品为起始材料，高效扩增物种基因片段，可显著提高工作效率。当有大量样品需要处理时，这一优势则更为明显，刘飞等[39]基于此种方法对225个蚂蟥样本进行遗传多样性分析就大大节省了时间和人力。DNA条形码鉴定技术不受形态特征和生物个体发育的限制，且检测样本范围广，易于实现自动化和标准化，在中药水蛭鉴定中已经表现出巨大的应用潜力，基于COI序列的DNA条形码技术可很好地鉴别水蛭、宽体金线蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、日本山蛭、八目石蛭等物种，高效、准确。由于COI序列长度较长(658 bp)，传统DNA条形码技术对DNA严重降解样品和混合样品的鉴定较为困难，需要借助Mini-barcode技术[70]或联合高通量测序技术进行鉴定。在蛋白质标记技术中，已有研究表明：SDS-PAGE法可鉴别蚂蟥与菲牛蛭；同工酶鉴定技术可鉴定分离日本医蛭和天目山蛭；表面增强激光解析电离飞行时间质谱技术可实现了对几种水蛭蛋白的分离鉴定。因此，蛋白质标记技术在中药水蛭鉴定中也发挥重要作用。随着计算机科学、生物学以及操作技术的不断更新，中药鉴定实现了标准化和数字化，中药水蛭的鉴定方法在分子鉴定技术中也得到了进一步发展与完善，各项分子鉴定技术也有其优点与局限性，根据不同的特点可鉴定不同的水蛭品种，可见表1。

3.3 总结与展望 在传统物种分类基础上，结合基因分子水平进行系统发育、遗传进化、系统分类等方面的研究，寻找不同物种间基因分子水平的差异，使得水蛭鉴定方法更加具有科学性与多样性，DNA条形码鉴定技术具有广阔的应用前景。近年来，电化学传感检测技术备受关注，基于DNA测序、DNA/蛋白质相互作用以及生物分子检测等，灵敏度高、操作简单，目前该技术已应用在了鱼类HIV病毒检测方法构建[71]、甘草提取液中大肠杆菌的快检[72]，将该技术与纳米技术结合成功实现将西红花与它的6种掺假药精确鉴别[73]。宏条形码技术(DNA Metabarcoding)结合了DNA条形码和高通量测序技术可以对混合样本中所有物种的DNA片段进行同时检测，Jia等[74]基于ITS2和psbA-trnH片段，以单分子实时测序技术(SMRT)对中成药益母丸的成分进行有效检测鉴定。Xin等[75]结合了宏条形码技术和SMRT技术对中成药九味羌活丸进行物种鉴定，结果可高效、灵敏地检测九味羌活丸中各原药材的基原。石林春等[76]利用宏条形码技术对中成药如意金黄散中的原料药材进行了物种基原识别鉴定，结果除厚朴外的全部处方成分均可被检测到，鉴定出掺杂了混伪品朝鲜苍术和虎掌南星。Shotgun metagenomics技术可以克服宏条形码技术对PCR扩增成功率的依赖，Xin等[77]对市售中成药龙胆泻肝丸采用了Shotgun metagenomic sequencing进行鉴定，发现其中含有木通的混伪品。目标测序技术(Target Sequencing)信息量大，可以完整覆盖整个基因区域，获得高频SNP分型数据，对于低频的和个体特有的变异也能够识别，已成功应用在了271个商业辣椒品种多态性的检测鉴定[78]。可以预见，这些新技术可应用在中成药中水蛭成分的鉴定，对中药水蛭鉴定技术的发展起到推动作用，使鉴定结果更加合理准确，保障中药水蛭在临床中的有效应用。

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